一：熒光抗體染色

于已固定的標本上滴加經(jīng)適當稀釋的熒光抗體。置濕盒內(nèi)，在一定溫度下溫育一定時間，一般可用
25～37℃ 30min，不耐熱抗原的檢測則以4℃過一夜為宜。用PBS 充分洗滌干燥。

熒光顯微鏡檢查應(yīng)在通風良好的暗室內(nèi)進行。經(jīng)熒光抗體染色的標本應(yīng)在染色當天鏡檢，每次鏡下觀察時間以1～ 2h 為宜，時間過長將使高壓汞燈的發(fā)光亮度下降，熒光減弱，工作人員觀察過久對眼睛也有不良影響。作油鏡檢查時，必須用無自發(fā)熒光的鏡油。

二：影響熒光抗體染色的各種因素

. pH   熒光素在溶劑中基本上處于離子化狀態(tài)，因此，溶劑中的氫離子濃度對熒光強度的影響是極大的。每一種熒光素都有自己合適的pH值，它保持熒光素分子與溶劑之間的電離平衡。pH的改變可以引起熒光素熒光光譜的改變，并可造成熒光強度的降低。

. 溫度   一般情況下，環(huán)境溫度的升高對熒光染色有明顯的影響。因為，溫度升高可造成溶液粘滯性增加，溶劑和熒光素分子的動力增大，使熒光淬滅的可能性隨之加大，這就使熒光素分子與其他分子之間的相互碰撞幾率增加，因此，影響了熒光素的熒光強度。一般情況下，溫度在20℃時，熒光素即開始表現(xiàn)溫度淬滅作用。隨溫度升高，熒光淬滅作用就越強，可至熒光*淬滅。溫度在20℃以下，熒光素的熒光強度隨溫度的變化改變不明顯，基本上保持恒量。因此，在適當?shù)牡蜏丨h(huán)境中進行熒光顯微觀察，可得到更好的效果。

. 熒光素的濃度   在溶液濃度較稀時，熒光強度隨熒光素濃度增加而增加。當熒光素濃度增加到一定程度時，熒光強度達到zui大。再繼續(xù)增加濃度，熒光素發(fā)生的光可能被鄰近的分子吸收，使熒光強度下降。

. 某些細胞固定劑對熒光素有明顯影響   如甲醛固定的細胞比不固定的細胞熒光強度減弱50%左右。雖然醇類固定劑也有輕微的淬滅熒光作用，但其影響較小。

. 非特異性熒光染色   免疫熒光染色除特異性熒光之外，還出現(xiàn)一些與靶抗原-抗體反應(yīng)無關(guān)的熒光，統(tǒng)稱為非特異性熒光。非特異性熒光染色可由于某些抗原的自發(fā)熒光及交叉反應(yīng)等多種因素產(chǎn)生。有些非特異性熒光染色可通過對照進行鑒別與排除，有些則要通過對抗原的純化、抗體的提純、提高熒光抗體結(jié)合物的比例等方面尋找原因逐項清除。

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